酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验
      ①直接法    该方法直接利用抗原与酶联抗体的结合，较简单易行。a.假抗原。在聚苯乙烯酶标版的孔穴中加入待检测的抗原（捕食者胃内含物抽提液）0.2ml，在4℃冰箱中过夜，使抗原黏附于塑料孔壁上。b.洗涤两次，倒置于干毛巾上，使孔穴中的液体尽量流出。c.加酶联抗体。各孔穴中加入酶联抗体0.2ml，在ml37℃下孵育3h，使其充分结合。d. 加底物。用pbs充分洗涤以除去未结合的酶联抗体，然后加入底物（邻苯二胺）0.2 ml，于37℃反应30min，用2mol/l硫酸0.05 ml终止反应。e. 用elisa检测仪测定其吸光度值，分别设阳性、阴性和空白对照，以确定阳性反应临界值。
       ②双抗体夹心法   该方法与直接法的不同在于吸附抗体。a. 包被抗体。酶标板的孔穴中加入0.2 ml抗体（用ph=9.6/0.05mol/l碳酸盐缓冲液稀释），置37℃水浴中孵育3h,移入4℃冰箱过夜。将各孔中多余的抗体倾去，加入pbs洗涤，立即甩去，再将pbs加满各板孔，置5min,甩去溶液，如此洗涤2次，倒置于干毛巾上，使孔穴中的液体尽量流出。b. 加待检抗原。没孔中加入待检捕食者胃内含物抽提液0.2 ml.同时设阳性、阴性和空白（pbs）对照，37℃水溶中孵育3h，转入冰箱中过夜。如上法洗涤3次。c. 加入酶联抗体。每孔加入酶联抗体0.2 ml，37℃水浴孵育2h，如上法洗涤3次。d. 加底物。每孔加入底物邻苯二胺0.2 ml, 37℃水浴孵育1h,加入2mol/l硫酸0.05，以终止反应。e. 用 elisa检测仪测定其吸光度值。
      ③间接法与前两种方法不同点在于酶联抗体与抗原的间接结合。a. 每孔加入待检抗原0.2 ml ，4℃冰箱中过夜，使抗原黏附于塑料孔壁上。并依上法洗涤3次。b. 每孔加0.2 ml,用pbs稀释的抗体，37℃孵育2-3h。c.用pbs洗涤3次后，加入溶于pbs的酶联抗体0.2ml，37℃孵育2-3h。d. 加底物，方法同上。e. 用elisa检测
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