非洲猪瘟现状及检测方法简介


非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。临床上以猪高热、食欲废绝、皮肤发绀、内脏实质、器官出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱为主要特征。被世界动物卫生组织(oie)列为必须报告的动物疫病,在我国倍列为一类动物疫病。该病病程极短,死亡率极高,已对发病国家的养猪业造成灾难性打击。
2018年7月,辽宁省沈阳市发生首例非洲猪瘟疫情,截止2019年上半年,全国共发生非洲猪瘟疫情100余起,包括25个省份(安徽、贵州、河南、黑龙江、湖北、湖南、吉林、江苏、辽宁、内蒙古、山西、陕西、天津、云南、浙江、重庆、江西、福建、四川、上海、北京、青海、广东、甘肃、宁夏),非洲猪瘟对我国养猪业的危害日益严峻。
asfv是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的wei一成员,病毒基因组全长170~ 190 kb ,为有囊膜的双股线状dna病毒,病毒粒子大小为175~215 nm,呈正二十面体结构。该病毒可使各种日龄和品种的家猪与野猪感染并发病,病毒可在多数蜱种中增殖,使蜱成为病毒的贮藏宿主和主要传播媒介。该病毒最早于1921年在非洲东部肯尼亚首次被发现,随后开始在撒哈拉以南的非洲东部、中部、南部等地区蔓延。1957 年病毒从非洲的安哥拉传到欧洲的西班牙,病毒开始在欧洲呈零星、持续流行。1971 年病毒从西班牙传入南美洲的古巴,南美洲和拉丁美洲的多数国家陆续暴发疫情。2007年病毒传入欧亚接壤的高加索地区,随后开始向俄罗斯南部地区扩散流行,2017年传播至俄罗斯远东地区伊尔库茨克,导致传入我国的风险空前升高。2018年7月末,辽宁省沈阳市一养猪户饲养的猪陆续发生不明原因死亡,病死猪剖检发现脾脏异常肿大,疑似非洲猪瘟病毒感染,经国家外来动物疫病研究中心检测,确诊为非洲猪瘟病毒核酸阳性,通过序列分析发现引起该疫情的非洲猪瘟病毒b646l/p72基因序列与俄罗斯毒株100%匹配,与俄罗斯和东欧目前流行的格鲁吉亚毒株( georgia 2007 )属于同-进化分支,这是我国发现的首例非洲猪瘟,目前阶段,面对非洲猪瘟还是以防疫销毁为主。那么问题来了,当猪类养殖户或者猪肉产品加工企业应该如何检测非洲猪瘟?依据哪些国家标准来进行检测呢?
有关非洲猪瘟的检测标准主要有:
gb/t 18648-2002 《非洲猪瘟诊断技术》 、 
sn/t 1559-2010  《非洲猪瘟检疫技术规范》、 
szdb/z131-2015《非洲猪瘟病毒抗体检测阻断酶联免疫吸附法》 、 
t/cvma 5-2018 《非洲猪瘟病毒实时荧光 pcr 检测方法》 等。
这其中 gb/t 18648-2002 《非洲猪瘟诊断技术》制定时,我国还尚未发现非洲猪瘟,所以只介绍了聚合酶链式反应试验(pcr)和酶联免疫吸附试验(elisa)两种试验方法。更多具体检测试验方法可以依据sn/t 1559-2010  《非洲猪瘟检疫技术规范》来进行。其次,有关非洲猪瘟病毒鉴定检测的试验主要病毒红细胞吸附试验(had)、病毒荧光抗体试验(fat)、聚合酶链式反应试验(pcr)、基因组taqman探针荧光pcr试验、酶联免疫吸附试验(elisa)、间接荧光抗体试验(ifat)、免疫印迹试验等。
下面对主要的几种检测方法做一个简单的介绍
1. 胶体金试纸检测方法
胶体金试纸检测方法是以胶体金作为示踪标志物,利用层忻技术实现抗原抗体特异性检测的一种新型的免疫检测技术。该方法具有快速、灵敏、特异等优点,该方法操作简单,无需仪器设备,直接采血滴加到试纸条上20分钟即可查看结果,尤其适合临床的快速诊断,但该方法的敏感性较高,易出现假阳性。
2.pcr法
pcr方法操作简单、检测快速,是目前最简单的分子生物学检测技木,但该方法的敏感性有限,且扩增后电泳检测需要使用溴化乙锭,具有一定的毒性。pcr检测方法具有很好的实用性,检测结果准确率较高,可以有效地应用于asf的诊断以及防控。
3. 荧光定量pcr方法
实时荧光定量pcr方法是将光谱技术引入到pcr反应中,通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量,解决了常规pcr方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。荧光定量pcr方法敏感性高、特异性强,已逐步成为asfv的临床诊断、检疫、食品安全检验的重要方法。
4. elisa方法
    elisa方法高通量、检测快速、操作简单,是目前常用的免疫学诊断技术,可用于猪群中asfv感染的大规模调查。该方法具有敏感性高、重复性好、特异性强、准确性高等特点。但作为血清学检测技术该方法具有一定的滞后性,无法对asfv的早期感染做出诊断。
在我国的《国家中长期动物疫病防治规划( 2012-2020)》中,asf被列为优先防范的13种重大外来动物疫病之一,且我国已发生首例 asf疫情,该病但在我国广泛流行,将给我国养猪业及养猪相关产业造成巨大冲击。目前应加强流行病学调直和主动监测排查工作,保持高度警惕,防止该病在我国的进一步流行。
本文简单介绍了asf各种诊断技术方法的优缺点,综合比较来看,目前荧光定量pcr法是效果较好,污染较小的检测方法,广泛适用于养殖场、屠宰场、畜牧、疾控、食品企业、检测机构等领域,是非洲猪瘟防控的优选检测方法。
荧光定量pcr非洲猪瘟检测 配置方案
序号
名称
规格型号
单位
数量
备注
1
便携式实时荧光定量pcr仪
16孔   双通道

1
核心部件全进口
选配配件
序号
名称
规格型号
单位
数量
备注
1
迷你离心机
 

1
实验所需仪器
2
移液器
10μl

1
实验所需仪器
3
移液器
200μl

1
实验所需仪器
4
旋涡震荡仪
 

1
实验所需仪器
5
u盘
16g

1
数据储存
6
非洲猪瘟荧光检测pcr试剂盒
 

1
 
7
pcr八连管
 

30
实验所需耗材
8
10μl吸头
96支/盒

1
实验所需耗材
9
200μl吸头
96支/盒

1
实验所需耗材
10
1.5ml离心管
 

200
实验所需耗材
11
乳胶手套
 

30
个人防护
12
1.5ml离心管架
60孔

1
实验所需耗材
13
pcr管架
96孔

1
实验所需耗材
14
医用口罩
 

10
个人防护
15
记号笔
黑色

1
样本标记编号
16
计时器
 

1
实验计时
17
冰盒
蓝色

1
样品保存用
18
实验用剪刀
 

1
实验用

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