这有一份FFPE样本建库的档案，还不赶紧Pick?
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什么是ffpe？ffpe（formalin-fixed and parrffin embedded），即福尔马林固定石蜡包埋样本。由于这种处理方法能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本，所以在临床病理检验、肿瘤基因检测中应用广泛。在世界范围内，大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中，其中绝大多数是使用福尔马林固定石蜡包埋的方法处理的样品。
ffpe样本通常代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料，为阐明疾病机制、回顾性研究等提供了宝贵的资源，但是由于样本制备以及储存等多方面的原因，ffpe样本中的dna质量往往很差。所以如何通过ffpe样本中获得的dna建立合格的文库已成为当前测序研究领域亟待解决的问题。
图1 ffpe样本
为何ffpe样本中的核酸质量差？ffpe样本特殊的制作方法和保存过程都会对核酸分子造成多方面的影响。组织医学样本在离体后即开始发生降解，福尔马林的固定使组织中的核酸与核酸或核酸与蛋白之间交联，石蜡的渗入过程进一步加速核酸的降解，保存时间及环境对样品中的核酸也有极大的影响。上述这些原因蕞终导致样本中的核酸质量受到严重的干扰和影响，比如假阴性和假阳性。其中假阳性的出现对于基因检测，尤其是低频突变的检测会造成很大的干扰。
表1 影响ffpe样本中dna质量的主要因素
因素
结果
核酸与蛋白发生交联
影响核酸提取的质量
磷酸二脂键的水解
导致dna的片段化
胞嘧啶脱氨基
引入c→t，g→a等突变
如何提高ffpe样本的建库质量？1. 样本质量控制
对于高质量的dna样本，通过吸光度检测样品纯度（nanodrop）和荧光定量（qubit）进行质量检测即可，但是这对于ffpe样本来源的dna是远远不够的， 需要进一步的质控评估。目前主要的方法有以下两种：
1）通过对广泛存在于gdna的alu序列（alu 247与alu 115）的qpcr扩增产物比值来衡量dna的完整性；
注：alu247/alu115：alu序列是广泛分布于人基因组的约300bp短重复序列。通过长 (247 bp; alu247) 、短(115 bp; alu115) 扩增子比值可评估gdna的完整度。
q score：即quality score，是指不同qpcr扩增产物浓度的比值。常用的q129/q41和q305/q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。
2) din：即 dna integrity number，是指dna经安捷伦生物分析系统 2200/4200 tapestation分析并计算的出的数值，是对dna完整性的评分。
表2 ffpe样本质控参数
原理
质控参数
理想样本参数值
高质量ffpe样本值
使用不同长度的引物来扩增大量存在于人类基因组中的序列，
根据其qpcr产物的比值评估
alu 247 / alu 115
1
0.4
q129/q41, q305/q41
1
q129/q41>0.4
agilent
din
9.8
>3.5
2. 样本损伤修复
ffpe样本由于制作与储存等多方面的原因导致样本质量不佳，如果质控之后样本质量很差，可对样本dna进行修复。通常修复液由不同的酶类根据不同比例混合而成，能够对dna样本中胞嘧啶脱氨成尿嘧啶、切刻或者缺口等问题能够进行修复，进而从整体上提升建库成功率。
表3 ffpe 修复试剂作用
损伤类型
是否修复
胞嘧啶脱氨成尿嘧啶
√
切刻与缺口
√
碱基氧化
√
3’端封闭
√
dna//片段化
×
核酸蛋白交联
×
通常情况下，ffpe修复试剂可以通过对样本的修复显著提高低质量ffpe样本的建库产出，而对高质量ffpe样本的建库产量提升并不明显（如下图所示）。
图2 ffpe修复试剂盒对建库产量的影响（input dna: 10 ng; cycles：10）
数据来源于翊圣ultimatm dna建库试剂盒（cat12199）测试结果，ffpe修复试剂为翊圣ffpe dna repair reagent(cat#12606)
3. 样本高效建库
高效的建库试剂盒能够蕞大程度的利用有限的样本，使其转化为合格的文库。ffpe样本由于样本浓度更低，质量较差，往往对试剂盒的要求也更高，搭配更高效的建库试剂盒也成为了ffpe样本建库的必备之选。
建库试剂盒的效率评估指标主要3个方面：
ngs建库文库转化率：指文库中两端都连上接头的目的片段占总片段数的比值。文库转化率影响文库的多样性与文库的质量，高的文库转化率一定程度上意味着文库丰度与测序的覆盖度更好，尤其是在ffpe样本中可能出现一些其他类型损伤的情况下，转化率过低势必会影响蕞终文库的产出与文库的丰度。
图3 双端连接的文库通过桥式扩增成簇
文库扩增均一性：指的是读取数据在基因组或目标区域的分布均一程度。其生信分析图如图4所示，一般认为覆盖越均匀，达到特定深度所需的测序数据就越少，覆盖均一性的偏向通常是在dna片段化和文库扩增步骤中引入的。
图4 不同gc含量样本测序数据均一性
文库扩增效率与保真性：文库扩增效率即获得特定文库产量所需的循环数，循环数越低意味着扩增效率越高；保真性即pcr扩增中出现碱基错配的数量，相同循环数条件下，错配数量少则保真性越高。
十年匠心品质，只为一颗初心——ultimatm，就是你要的档案hieff ngs® ultima dna library prep kit（cat#12199）是翊圣生物针对illumina测序平台研发的高效dna建库试剂盒，本品采用高质量酶学组成，具有优异的文库转化率与扩增效率，彻底解决ffpe/cfdna建库难的问题。多样本验证，同等条件下文库产量是k*品牌的1-3倍。适用于常规动植物基因组、微生物基因组、ffpe、cfdna、chip dna等所有样本建库，助力获得优异的测序数据。
精简流程：末端修复与a尾巴添加一步完成，无需纯化，大大缩减建库时间；
极高效的dna连接酶： 自主创新研发高效dna连接酶fast t4 dna ligase，多样本验证连接效率是n*品牌的2-3倍；
强扩增效率的高保真酶：自主创新研发强扩增效率高保真酶canace®ⅱ，极大降低文库扩增带来的偏好性。性能媲美k*品牌h*fi酶；
图5 ultimatm建库试剂盒多样本验证均可获得优异的文库质量
往期精彩推送：1. 划重点！ngs中dna建库方法全面解析
2. mrna建库完全攻略——从mrna纯化到注意事项
3. 测序数据不好？是不是建库出了问题？！
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ffpe样本通常代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料，为阐明疾病机制、回顾性研究等提供了宝贵的资源，但是由于样本制备以及储存等多方面的原因，ffpe样本中的dna质量往往很差。所以如何通过ffpe样本中获得的dna建立合格的文库已成为当前测序研究领域亟待解决的问题。
图1 ffpe样本
为何ffpe样本中的核酸质量差？ffpe样本特殊的制作方法和保存过程都会对核酸分子造成多方面的影响。组织医学样本在离体后即开始发生降解，福尔马林的固定使组织中的核酸与核酸或核酸与蛋白之间交联，石蜡的渗入过程进一步加速核酸的降解，保存时间及环境对样品中的核酸也有极大的影响。上述这些原因蕞终导致样本中的核酸质量受到严重的干扰和影响，比如假阴性和假阳性。其中假阳性的出现对于基因检测，尤其是低频突变的检测会造成很大的干扰。
表1 影响ffpe样本中dna质量的主要因素
因素
结果
核酸与蛋白发生交联
影响核酸提取的质量
磷酸二脂键的水解
导致dna的片段化
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对于高质量的dna样本，通过吸光度检测样品纯度（nanodrop）和荧光定量（qubit）进行质量检测即可，但是这对于ffpe样本来源的dna是远远不够的， 需要进一步的质控评估。目前主要的方法有以下两种：
1）通过对广泛存在于gdna的alu序列（alu 247与alu 115）的qpcr扩增产物比值来衡量dna的完整性；
注：alu247/alu115：alu序列是广泛分布于人基因组的约300bp短重复序列。通过长 (247 bp; alu247) 、短(115 bp; alu115) 扩增子比值可评估gdna的完整度。
q score：即quality score，是指不同qpcr扩增产物浓度的比值。常用的q129/q41和q305/q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。
2) din：即 dna integrity number，是指dna经安捷伦生物分析系统 2200/4200 tapestation分析并计算的出的数值，是对dna完整性的评分。
表2 ffpe样本质控参数
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1
0.4
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1
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ffpe样本由于制作与储存等多方面的原因导致样本质量不佳，如果质控之后样本质量很差，可对样本dna进行修复。通常修复液由不同的酶类根据不同比例混合而成，能够对dna样本中胞嘧啶脱氨成尿嘧啶、切刻或者缺口等问题能够进行修复，进而从整体上提升建库成功率。
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√
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√
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√
3’端封闭
√
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×
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×
通常情况下，ffpe修复试剂可以通过对样本的修复显著提高低质量ffpe样本的建库产出，而对高质量ffpe样本的建库产量提升并不明显（如下图所示）。
图2 ffpe修复试剂盒对建库产量的影响（input dna: 10 ng; cycles：10）
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ngs建库文库转化率：指文库中两端都连上接头的目的片段占总片段数的比值。文库转化率影响文库的多样性与文库的质量，高的文库转化率一定程度上意味着文库丰度与测序的覆盖度更好，尤其是在ffpe样本中可能出现一些其他类型损伤的情况下，转化率过低势必会影响蕞终文库的产出与文库的丰度。
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